Matériel :
lames, colorants

Mode opératoire :

• Réaliser un frottis ou un étalement
• Fixer la préparation à la flamme, sécher soigneusement puis laisser refroidir la lame.
• Immerger les lames dans la solution de Cristal Violet pendant 1mm.
• Lavage à l'eau en transvasant les lames
• Immerger les lames dans du Lugol en les agitant
• Laver à nouveau à l'eau
• Décolorer jusqu'à disparition de la couleur violette dans l'alcool en faisant couler goutte à goutte sur la lame inclinée ou en immergeant les lames pendant une dizaine de secondes dans le décolorant.
• Laver à l'eau.
• Contre colorer avec la solution de safranine diluée pendant 20 à 30 secondes.
• Laver à l'eau et sécher à l'air.
• Observer à l’objectif X100, en immersion avec de l'huile.

Résultat :
Les bactéries gram + sont colorées en violet, les bactéries gram - sont colorées en rose, ceci étant du à une différence de composition de la paroi
Lorsque l'on colore peu de lames, plutôt que d'immerger les préparations, on peu les recouvrir de colorants. Le décolorant doit être changé chaque jour.

Risques d'erreurs :

Faux Gram (+) :

• Étalement trop épais,
• Dépôt de colorant dans le flacon de violet de gentiane : filtrer le colorant pour y remédier,
• Solution iodée de Gram mal égouttée,
• Décolorant laissé trop peu de temps (globalement, mieux vaut trop que pas assez.
• Solution de safranine laissée très longtemps (plus d'une minute).

Faux Gram (-) :

• Solution iodée de Gram laissée trop peu de temps,
• Décolorant laissé trop longtemps et mal rincé,

Réactifs :

1- Violet de gentiane - adaptation de Hucker :

SOLUTION A :

• Violet de gentiane 2 g
• Alcool à 95° 20 ml

SOLUTION B :

• Oxalate d'ammonium : 0,8 g
• Eau distillée 80 ml

Mélanger les solutions A et B, Laisser reposer 24 heures avant l'emploi, Verser à travers un papier filtre dans un flacon.

2- Solution iodée de gram

• Iode 1 g
• Iodure de potassium 2 g
• Eau distillée 300 ml

Dissoudre d'abord l'iodure de potassium dans environ 30 ml d'eau distillée, ajouter l'iode et mélanger jusqu'à dissolution. Ajouter le reste d'eau distillée, mélanger.
Conserver dans un flacon en verre brun ou en plastique opaque (à l'abri de la lumière).

3- Solution de safranine

SOLUTION A :

• Safranine O 2,5 g
• Alcool à 95° qsp 100 ml

SOLUTION A bis :

• Solution A 10 ml
• Eau distillée 90 ml

4- Décolorant

Mélanger à parties égale alcool à 95 ° et acétone. Le mélange est à faire extemporanément.