Note : il existe une variante plus simple et plus rapide de cette coloration, elle nécessite cependant un four à micro-ondes. Écrivez-nous si vous êtes intéressés.

But :

Mise en évidence des kystes de Pneumocystis carinii. Cette méthode est la méthode de référence, mais elle est difficile, chère et longue. Elle est donnée à titre indicatif. 

Matériel nécessaire :

Un petit portoir à lames en métal, une petite casserole en aluminium, une petite casserole en verre transparent pyrex, 15 bacs à coloration, eau distillée, thermomètre, chronomètre, pince pour le portoir, bleuet butagaz, alcool à 95°, alcool absolu. Réactifs. Gants et masque.

Préparation des 15 bacs :

• 6 bacs contenant de l'eau distillée, numérotés de E1 à E6
• 1 bac contenant une solution de bisulfite de sodium à 1 % (B1)
• 1 bac contenant une solution de chlorure d'or à 0.2 % (B2)
• 1 bac contenant une solution de thiosulfate de sodium à 2 % (B3)
• 1 bac contenant une solution de vert lumière à 1 % (B4)
• 1 bac d'alcool à 95° (B5)
• 2 bacs d'alcool absolu (B6-B7)
• 2 bacs de méthylcyclohexane (B8-B9)

Ces réactifs se conservent bien, à l'abri de la lumière.

Autres réactifs :

1. Solution mère d'hexaméthylèneamine-argent :
   Mélanger 27 g d'hexaméthylèneamine, 45 ml d'une solution de nitrate d'argent à 5 % et 900 ml d'eau distillée. Cette solution se conserve 6 mois au réfrigérateur et à l'abri de la lumière.
2. Solution extemporanée d'hexaméthylèneamine-argent
3. Solution extemporanée d'acide chromique à 5 %

Coloration :

1. Disposer les lames sur le portoir en métal.
2. Dans la casserole en aluminium, mélanger 15 grammes d'acide chromique à 300 ml d'eau distillée. Chauffer en mélangeant et en vérifiant la température au thermomètre. A 65°, enlever la casserole du feu.
3. Plonger le portoir pendant une minute exactement dans la casserole.
4. Laver successivement dans les bacs E1 et E2.
5. Pendant le lavage, préparer la solution extemporanée d'hexaméthylèneamine-argent : dans la casserole transparente, mélanger 100 ml d'eau, 8 ml de borate de sodium à 5 %, 60 ml de DMSO et 100 ml de solution mère. On obtient une solution blanc-gris opaque.
6. Après le lavage, plonger le portoir dans le bac B1 pendant une minute exactement.
7. Placer ensuite le portoir dans la casserole transparente et faire chauffer en mesurant la température (avec un thermomètre propre !). Enlever la casserole à 90°.
8. Sortir le portoir de la casserole lorsque les lames deviennent légèrement marron.
9. Laver successivement dans les bacs E3 et E4.
10. Plonger le portoir pendant 1 minute dans le bac B2, laver rapidement dans E5.
11. Plonger le portoir pendant 1 minute dans le bac B3, laver rapidement dans E6.
12. Plonger le portoir pendant 5 minutes dans le bac B4, laver doucement au robinet jusqu'à élimination du vert en excès.
13. Passer successivement pendant 1 minute dans les bacs B5 à B9.

Observation :

Observer aux objectifs 10 et 40 puis à l'immersion. La lecture est longue, elle est réservée à des techniciens avertis.
On observe des petits kystes de diamètre 3.5 à 5 µm, bruns ou noirs sur fond vert, arrondis ou en cupule. Leur paroi régulière peut présenter un point d'épaississement réalisant une "image en parenthèse". 

Lavage de la vaisselle :

Le contenu des deux casseroles doit être jeté séparément dans des bidons en plastique prévus spécialement pour eux. Ils sont ensuite à évacuer vers un centre spécialisé.
Rincer la casserole en aluminium à l'eau.
La casserole transparente est remplie d'eau additionnée d'une giclée d'HCl concentré. Laisser agir une nuit puis rincer à l'eau puis à l'eau distillée.